Лабораторная работа по биологии
учебно-методический материал по биологии (8 класс) на тему
Действие ферментов слюны на крахмал
Скачать:
| Вложение | Размер |
|---|---|
| Действие ферментов слюны на крахмал | 112.5 КБ |
Предварительный просмотр:
Инструктивная карта для учителя:
Приготовление накрахмаленного бинта для лабораторной работы «Действие фермента слюны на крахмал» и ее проведение.
1 Нальем в кастрюлю стакан холодной воды и разведем в ней пол-ложки крахмала Нальем в кастрюлю стакан холодной воды и разведем в ней пол-ложки крахмала
2 На небольшом огне доведем жидкость до кипения и будем варить еще 5-10 мин, постоянно помешивая, до образования однородной клейкой массы.
3 Смочим в крахмальном клейстере бинт и дадим ему просохнуть.
4 Далее приготовим реактив на крахмал – йодную воду ( нальем в блюдце немного воды и добавим несколько капель йода, чтобы получилась жидкость цвета крепко заваренного чая).
5 Возьмем ватную палочку, смочим ее слюной, затем на накрахмаленном бинте слюной напишем букву.
6 Расправленный бинт подержим в руках некоторое время, чтобы он нагрелся. Затем опустим бинт в йодную воду, тщательно расправив его.
7 Участки, где остался крахмал, окрасятся в синий цвет, а места, обработанные слюной, останутся белыми, так как крахмал в них распался до глюкозы, которая с йодом синего окрашивания не дает (на синем фоне появится белая буква).
8 Вывод: в состав слюны входит фермент, который расщепляет крахмал. Фермент проявляет свою активность при определенных условиях: щелочной реакции среды и температуре 36,6- 37 o С.
Бланк лабораторной работы для учащихся:
Лабораторная работа № __
«Действие ферментов слюны на крахмал»
Оборудование: кусок накрахмаленного накануне сухого бинта/марли величиной с ладонь, чашка Петри со слабым раствором йода, ватные палочки.
Цель работы: выяснить, какое действие на крахмал оказывают ферменты слюны
- Смочите ватную палочку слюной и напишите ею букву в середине кусочка накрахмаленного бинта.
- Зажмите расплавленную марлю/бинт между ладонями на 2—3 мин, а затем опустите в раствор йода.
- Наблюдайте, как окрасился кусочек марли. Объясните результаты опыта.
Источник
Преобразование крахмала
Преобразование крахмала
Сухие вещества в сусле на 90-92% состоят из углеводов (карбогидратов) [Briggs, 2004]. Белок же занимает всего 4-5%, остальное это витамины, минералы и рассеянные микроэлементы. Углеводы на 95% являются продуктом преобразования крахмала в заторном баке. Затирание — основной способ деградации крахмала в заторе. При этом из нерастворимого крахмала образуются сахара — топливо для дрожжей, необходимое для ферментации. Время, за которое происходит это преобразование, и условия определяют эффективность с которой потребляются ингредиенты сусла, степень сбраживаемости и качество сусла.
Во время затирания преобразованию крахмала предшествует его желатинизация. Этот процесс не является обязательным (хотя в процессе роста растения из зерна происходит точно такой же процесс), но преобразование крахмала ферментами (алфа-, бета-амилазой и предельной декстриназой) значительно ускоряется вымыванием амилозы и амилопектина из гранул крахмала.
Желатинизация
Образование крахмальных зерен начинается в определенных точках стромы пластиды, называемых образовательными центрами. Рост зерна происходит путем последовательного отложения слоев крахмала вокруг образовательного центра. Смежные слои в одном зерне могут иметь различный показатель преломления света, и тогда они видны под микроскопом – слоистые крахмальные зерна. Расположение слоев может быть концентрическим (пшеница) или эксцентрическим (картофель). Во время роста зерна слои чередуются, образовывая аморфную и кристаллическую последовательность.
Гранулы крахмала нерастворимы в холодной воде, впитывая в себя лишь её небольшой объем. Они формируют суспензию, быстро оседая без взбалтывания. С нагревом от 50 градусов гранулы поглощают больше воды, разбухая [Narziss, 2005]. На этом этапе объем поглощенной воды может быть больше размера зерна крахмала до тридцати раз. Поглощение воды происходит в аморфных слоях роста. В этот момент из гранулы крахмала начинает выщелачиваться амилоза, при этом кристаллические слои отрываются от гранулы, образуя желатиновые листы. При этом кристаллическая структура зерна крахмала теряется [Shetty, 2006]. Это и есть процесс желатинизцаии.
В то время как диапазон температур, при которых происходит желатинизация отдельных крахмальных зерен, весьма узок (
1C), желатинизация всего затора может происходить при большем разбросе температур. На рисунке 1 показаны диапазоны температур желатинизации разных крахмалосодержащих культур. Как видно из графика, при паузе осахаривания крахмала ячменя крахмал других растений далеко не всегда может желатинизироваться. Для осахаривания крахмала этих растений он должен быть полностью желатинизирован до паузы осахаривания. Так же проблемы могут возникнуть и с мелкими зернами крахмала. Они в отличии от крупных зерен требуют более высокой температуры. Этим свойством объясняются плюсы эффективности отварочного метода затирания.
Желатинизация требует достаточного объема свободной воды для набухания крахмала и разрыва водородных связей, поддерживающих кристаллическую структуру зерен. Если объем воды ограничен из-за высокой концентрации крахмала, набухание зерен уменьшается, и разрушение кристаллической структуры требует её расплавления [Donald, 2004]. Что требует повышения температуры желатинизации. Недостаток свободной воды может быть вызван наличием сахаров и других растворенных веществ. Например для кукурузного крахмала повышение содержания сахарозы в заторе на 25% повышает температуру желатинизации с 70 до 78С [Donald, 2004]. Это является одной из причин, по которой густой затор обладает меньшей эффективностью чем жидкий.
Во время желатинизации крахмала вязкость жидкой фракции дробины повышается. Это не так заметно в пивоварении как в готовке. В то же время ферменты (а частности α-амилаза) разрывают освободившиеся цепочки амилозы амилопектина. Этот процесс уменьшает вязкость затора и называется сжижением [Kunze, 2007]. Нагрев до 70-74C и последующая пауза уменьшает вероятность подгорания затора при отварочном методе.
Сильное увеличение вязкости зернового затора часто является серьёзной проблемой для пивовара. Особенно это заметно с варками риса, который очень сильно разбухает. Это ведет к подгоранию и остановке перемешивания сусла мешалками [Kunze, 2007]. По этой причине следует добавлять немного солода при температуре 75-80С (до того как вся α-амилаза будет денатурирована) для разжижения перед кипячением.
Температура желатинизации также зависит от условий роста зерновых и года урожая [Kunze, 2007]. Кесслер выяснил, что существует прямая зависимость температуры желатинизации от показателя солода «VZ 45C», которое является отношением экстракта, полученного при 45С и экстракта, получаемого при congress mash (особая процедура затирания при 70С). Этот параметр часто используется в спецификации солодов. На рисунке 2 представлена информация, полученная Кесслером. В соответствии с данными от компании Ваерманн, показатель VZ45 в их солодах достигает 35, что требует 65С для желатинизации. Эта температура не вызывает проблемы при одной паузе осахаривания, однако при мальтозной паузе, проводимой при 63С крахмал не сможет полностью желатинизироваться. В этом случае нужна дополнительная пауза на 65С для достижения требуемой сбраживаемости сусла.
Расщепление молекул крахмала ферментами
Преобразование крахмала в заторе по больше части ферментативный процесс, в котором принимают участие 4 типа ферментов. Наиболее известны α- и β-амилаза. Оба работают на α(1-4) гликозидных связях молекул крахмала и декстрина. Другой фермент — предельная декстриназа способна расщеплять α(1-6) гликозидные связи, формирующие узлы из нескольких цепочек амилопектина. И наконец — мальтаза, которая отщепляет молекулы глюкозы он нередуцированного конца дисахарида или полисахарида. Так как этот фермент быстро инактивируется при температурах выше 45 С, он обычно не играет важной роли.
α-амилаза — это фермент, способный расщеплять любую α(1-4) связь в крахмале или декстрине за исключением точек ветвления. Это расщепление гликолизидных связей называется гидролизом так как поглощает одну молекулы воды. Этот фермент отвечает за быстрое уменьшение вязкости затора и отсутствие «синей» йодной пробы после желатинизации крахмала. Этот процесс называется разжижением затора. В то время как α-амилаза хороша в расщеплении крахмала на декстрины, которые показывают коричневую йодную пробу вместо синей, она не слишком хороша для сбраживаемых сахаров. α-амилаза имеет особенность расщеплять более крупные молекулы.
β-амилаза подходит куда лучше для производства сбраживаемых сахаров. β-амилаза «откусывает» по 2 молекулы глюкозы с нередуцированного конца цепочки молекул одну за другой. Из-за принципа действия фермента в пивном сусле большая часть сахаров — это мальтоза. Действие фермента прекращается при приближении к связи α(1-6). После это требуется помощь α-амилазы или предельной декстриназы. Первая разорвет цепочку молекул и подготовит новый с нередуцированный конец, вторая разорвет связь α(1-6) и так же оставит новый с нередуцированный конец, с которым опять начнет работу β-амилаза. Это процесс называется осахариванием и обычно идет за разжижением затора. Если сусло должно быть хорошо сбраживаемым используют β-амилазу путем подходящей температуры затирания.
Для полного осахаривания недостаточно действия α- и β-амилазы. Причина тому связи α(1-6), которые составляют 6-7% в амилопектине. Тут нам и поможет предельная декстриназа. У этого фермента оптимальная температура 60-62,5 С (по другим данным 50-60 С), схожая с оптимумом для β-амилазы. Её нестабильность при 63-70 градусах является основной причиной большого числа предельных декстринов в сусле, которые не расщепляются α- и β-амилазой. Предельные декстрины придают пиву положительные свойства, поэтому их следует расщеплять только для получения хорошо сбраживаемого сусла.
| Тип Зерна | Солод (% сухих в-в) | Сусло (% сухих в-в) |
|---|---|---|
| Крахмал | 85,8 | 0 |
| Декстрины, Глюканы, Пентазаны | 2,5 | 22,2 |
| Фруктаны | 1,4 | ? |
| Мальтотетраоза | — | 6,1 |
| Мальтотриоза | 0,6 | 14,0 |
| Мальтоза | 1,0 | 41,1 |
| Сахароза | 5,1 | 5,5 |
| Глюкоза и Фруктоза | 2,4 | 8,9 |
| Всего | 98,8 | 97,8 |
Таблица 1. Сравнительное содержание карбогидратов в солоде и сусле
Оптимальный диапазон температур для мальтазы находится между 30 и 40 °С, она может отделять одну молекулу глюкозы от цепочки с нередуцированного конца. Этот фермент предпочитает простые молекулы с низкой полимеризацией, чаще выбирая для своей целью мальтозу [Kessler, 2006]. На деле мало интересна для затирания, так как требует замачивания ниже 40 °С. Если ставится цель поднять содержание глюкозы в сусле, то следует после осахаривания при 63-65 °С остудить сусло до 40 °С и провести пазу на 30-45 минут с добавлением дополнительной порции солода и свежего фермента. После чего следует повторно провести осахаривание. О таком затирании рассказал Маркус Германн из пивоваренной школы Ванштефан, оно способствует получению богатых эфирных пшеничных сортов пива [Hermann, 2005].
Сахараза и инвертаза также активны в заторе. Эти ферменты расщепляют сахарозу на фруктозу и глюкозу. В то же время сахарозы крайне мало в заторе, поэтому роль ферментов незначительна.
Потребление одной молекулы воды означает, что при производстве одного килограмма мальтозы (или эквивалентной смеси глюкозы, мальтозы и крупных сахаров/декстринов) крахмал потребляет 50 миллилитров воды. Типичный затор для получения 19 литров сусла употребит 150 миллилитров воды. Это 1% от всей воды, добавленной на затирание, он обычно опускается из расчетов.
Кунце описывает четыре различных этапа преобразования крахмала при затирании [Kunze, 2007]. При низких температурах крахмал не набухает и остается в воде в виде суспензии. После окончания перемешивания зерна крахмала быстро оседают на дно. При этом йодная проба не синеет, вязкость жидкой фазы низкая. Но даже при низкой температуре амилазы уже начали свою атаку на гранулы крахмала. С повышением температуры происходит желатинизация крахмала, освобождая молекулы амилозы и амилопектина. Эти крупные молекулы сгущают затор, его вязкость растет. Йодная проба черно-синяя на этом этапе. В этот момент амилазы (в особенности α-амилаза) и предельная декстриназа начинают быстро расщеплять молекулы амилозы и амилопектина на крупные декстрины, тем самым серьезно снижая вязкость затора. Этот процесс называется разжижением. Йодная проба становится менее синей и более красно-коричневой, что показывает общее уменьшение молекул крахмала. Декстрины становятся мельче, β-амилаза и предельная декстриназа начинают активнее работать, расщепляя их не ферментируемые сахара, в то время как α-амилаза оказывает предпочтение крупным молекулам. Этот процесс называется осахариванием, он завершается частой йодной пробой.
Влияние условий затирания
Такие условия затирания как температура, время, гидромодуль, pH и остальные влияют на сложное взаимодействие между ферментами и субстратами, качеством получаемого сусла. Контролируя эти условия, пивовар может серьезно влияет на состав сусла и вкус готового пива. Помимо качества сусла, изменяется и объем экстракта, получаемого из засыпи. Вот почему пивовар должен иметь хорошее представление о процессах, проходящих при затирании.
Ниже следует детальное описание условий, влияющих на разнообразные параметры затора.
Температура и время
Процесс затирания заключается в последовательности температурных пауз, выдерживаемых определенное время. В самом простом случае проводится только одна пауза. Такой способ затирания называется изотермическим или однопаузным. Температура и длительность выбирается таким образом, что только определенные ферменты работают над затором. Эффект от оптимальной температуры не является постоянным для ферментов, но в то же время зависит от длительности проводимой паузы. При низкой температуре ферменты работают медленней, в то же время сохраняя дольше свою жизнеспособность, расщепляя больше продукта.
В то время как при 55 °С ферменты могут переработать до 90% потенциального экстракта, температура желатинизации крахмала не достигается, поэтому для осахаривания выбирается более высокая температура. Таким образом ферменты используются наиболее эффективно.
| Фермент | Оптимальная температура, °С | Оптимальный pH (охлажденный образец) |
|---|---|---|
| Мальтаза | 30-40 | 6,0 |
| Сахараза, инвертаза | 50 | 5,5 |
| Предельная декстриназа | 60-62,5 | 5,1 |
| β-амилаза | 60-65 | 5.4-5.6 |
| α-амилаза | 72-75 | 5.6-5.8 |
Таблица 2. Оптимальные температура и pH по Нарциссу и Кунце
Температура затирания и его продолжительность напрямую влияют на сбраживаемость сусла. Сбраживаемость — это отношение между сбраживаемыми сахарами (глюкоза, мальтоза, мальтотриоза) и общим объемом экстракта. Так как большая часть экстракта углеводы, сбраживаемость напрямую связана с балансом между сбраживаемыми и несбраживаемыми продуктами расщепления крахмала. Этот баланс управляется интенсивностью работы β-амилазы и предельной декстриназы. Оба эти фермента более чувствительны к теплу, чем α-амилаза (Таблица 2), эта особенность и используется для управления их активностью, особенно при однопаузном затирании.
Чем дольше работает β-амилаза и предельная декстриназа, тем больше становится степень сбраживания сусла. При однопаузном затирании этот процесс управляется температурой. Чем выше температура, тем быстрее денатурируется β-амилаза, и меньше сбраживаемых сахаров производится. На низких температурах эти ферменты остаются активными и продолжают работу более медленно. Заметьте, что для получения нередуцированных концов цепочек молекул глюкозы требуется активность α-амилазы (особенно за точками ветвления молекул амилопектина). Хотя эта температура и не является оптимумом для работы α-амилазы, её активности достаточно. При многопаузном затирании сбраживаемость сусла контролируется длительностью мальтозной паузой при 60-64 С.
На Рисунке 5 показан процесс затирания трёх однопаузных заторов при трех разных температурах. Здесь наглядно видно, что при высокой температуре затор быстрее насыщается до максимума получаемого экстракта. Это результат того, что крахмал ограничен для преобразования, а ферментов в солоде более чем достаточно для его полного осахаривания из растворимого сырья. Только затирание при 60 С длится долго до насыщения. Это результат неполной желатинизации и меньшей активности ферментов при этой температуре. В то же время порог насыщения все равно был достигнут, так же как и в случае с другими температурами.
Выход экстракта зависит от температуры. Чем выше температура затирания, тем быстрее достигается максимум, после чего выход остается постоянным. Это результат быстрой денатурации β-амилазы и предельной декстриназы. Результат после 180 минут затирания при 65 С опережает затирание при 60 С, которое должно было дать больше сбраживаемых сахаров.
Показатель pH и вода для пивоварения
Показатель pH затора может существенно влиять на активность ферментов, так как помимо температуры напрямую влияет на их деятельность. Показателем pH можно так же управлять процессом затирания. Оптимальные диапазоны показателя pH можно увидеть в Таблице 3.
| Характеристика | pH при температуре затирания | pH охлажденного затора |
|---|---|---|
| Наименьшее время осахаривания | 5.3 | 5.7 |
| Наибольший выход экстракта | 5.2-5.4 | 5.55 — 5.75 |
| Наибольший выход экстракта с отваркой | 5.3-5.6 | 5.3-5.6 |
| Лучшая сбраживаемость | 5.1-5.3 | 5.4-5.6 |
| Максимальная активность α-амилазы | 5.3 | 5,7 |
| Максимальная активность β-амилазы | 5.1-5.3 | 5.4-5.6 |
| Максимальная активность фитазы | 5.2 | 5.5 |
Таблица 3. Оптимальный pH [Briggs, 2004]
Существует некая неточность измерения показателя pH, так как он зависит от температуры. Затор ведет себя как слабые кислоты, которые диссоциируют (становится больше ионов водорода) с ростом температуры. Известно, что показатель pH затора при 65 С на 0.35 pH ниже pH при 25 С и и выше на 0.4 при 75 С соответственно [Briggs, 2004]. Оптимальным pH для α-амилазы является 5.3 при комнатной температуре. Для затирания же считается оптимальным 5.7. Причина тут в том, что pH затора обычно измеряют при комнатной температуре. Измерение при температурах затирания возможно, однако большая часть оборудования предназначена для измерения охлажденных образцов.
Подходящий pH влияет не только на деятельность ферментов. Он влияет на характер как кипящего сусла, так и выкипевшего сула. Показатель pH при кипении может быть немногим выше значения при затирании, а выкипевшее сусло на 0.1-0.2 pH ниже, чем кипящее сусло.
α-амилаза стабилизируется наличием ионов кальция в заторе [Briggs, 2004]. Однако α-амилаза и так достаточно стабильна для преобразования всего крахмала при обычных температурах затирания. При затирании несоложеного сырья этот эффект может быть полезен, так как крахмала для желатиназации тут больше, а ферментов меньше. Стабильность β-амилазы не зависит от кальция, его концентрация не влияет на сбраживаемость сусла.
Гидромодуль
Гидромодуль может вносить большой вклад в скорость затирания. Очень густой затор с гидромодулем менее 2 тяжело мешать, выход экстракта мал, желатинизация и преобразование крахмала замедленно [Briggs, 2004].
Гидромодуль может быть самый различный. В традиционных английских варках затор может быть плотный (гидромодуль 2-2.5), в то время как в немецких варках затор пожиже (гидромодуль 3.5-5). Причина этому — использование различного оборудования. В традиционном английском пивоварении использовался инфузионный способ затирания с неподогреваемым фильтром-заторником, в то время как немецкие пивовары нагревали заторник, перемешивая затор. Далее затор перекачивался для отварки и в фильтр.
Амилазы стабильней в густом заторе (Риснуок 6). Это особенно актуально для чувствительной к повышенной температуре β-амилазы. Получается, что густой затор дает более сбраживаемое сусло чем жидкий при затирании на высоких температурах [Briggs, 2004]. В то время как густой затор сохраняет ферменты, он замедляет их активность из-за недостатка воды [Briggs, 2004]. Кроме того, желатинизация идет медленней и при более высокой температуре, в результате чего жидкий затор дает больше экстракта при стандартных температурах.
Рисунок 7 показывает данные экспериментов Виндиша, Кольбаха и Шильда. Здесь видно, как жидкий затор дает преобразовать больше экстракта из крахмала, а так же получить больше сбраживаемых сахаров. В то же время процент сбраживаемых сахаров остается постоянным при изменении гидромодуля. Здесь также есть информация по растворенному в сусле азоту. Как видно, жидкий затор имеет большую протеолитическую активность.
Сбраживаемость сусла так же немного зависит от гидромодуля, что соответствует исследованиям Нарцисса о том, что при использовании хорошо модифицированного солода сбраживаемость сусла слабо зависит от гидромодуля [Narziss, 2005]. В то же время в жидком заторе процесс преобразования крахмала идет лучше.
Помол
Помол так же играет большую роль в процессе. Особенно важна степень помола. Мелкий помол дает больше муки. Эндосперм лучше отделяется от оболочек. Так вода и ферменты лучше доставляются к крахмалу, что ведет к быстрой желатинизации и преобразованию. В результате имеем лучший выход экстракта и лучшую сбраживаемость. Пивовары стремятся делать настолько мелкий помол, сколько позволяет отфильтровать их система. Некоторые коммерческие пивоварни измельчают зерна в муку, но тогда для фильтрации используются специальные заторные фильтры.
С ростом выхода экстракта улучшение сбраживаемости не было обнаружено при мелком помоле.
Источник
