«Бактериологические исследования на туберкулез»
Бактериологические исследования на туберкулез
Бактериологический метод исследования патологического материала на микобактерии туберкулеза является более чувствительным, чем бактериоскопический. Надо, однако, иметь в виду, что в некоторых случаях под влиянием химиотерапии микобактерии туберкулеза могут не дать роста на питательных средах, в то время как при бактериоскопии они выявляются.
При бактериоскопии мазков из мокроты, окрашенных по Цилю — Нильсену, микобактерии могут быть найдены в тех случаях, если они содержатся в количестве около 500000 в I мл материала. Посев может дать положительный результат, если туберкулезные палочки содержатся в количестве нескольких десятков в I мл.
Для посева на микобактерии туберкулеза может быть использован любой материал, получаемый от больного (мокрота, моча, экссудаты, ликвор, промывные воды желудка, бронхов, мазки из гортани и т. д.), а также операционный и секционный материал. В большинстве случаев исследуемый материал, кроме туберкулезных микобактерий, содержит разнообразную постороннюю флору, которая на питательных средах растет гораздо быстрее туберкулезных микобактерий и препятствует росту микобактерий. Поэтому перед посевом материал подлежит специальной обработке.
Чаще всего в лаборатории приходится иметь дело с мокротой. При отсутствии у больного мокроты обычно исследуют промывные воды желудка В последнее время считается, что промывные воды бронхов дают больший процент положительных посевов, чем мокрота. Результаты посева мазков из гортани на тампоне, по литературным данным, уступают по количеству положительных ответов посеву мокроты, но он прост по технике взятия материала.
ОБРАБОТКА И ПОСЕВ МОКРОТЫ. Для посева мокроту собирают в стерильную баночку или плевательницу. Перед посевом больной должен прополоскать рот и зев кипяченой водой. Для исследования лучше брать первую утреннюю порцию мокроты до утреннего приема лекарств. Для освобождения мокроты от вторичной флоры при посеве применяют обработку серной кислотой по методу Гона или Мазура. Оригинальные методы, предложенные в свое время этими авторами, в последнее время были значительно видоизменены. Изменение методов обработки материала в основном сводится к снижению концентрации кислоты, применяемой для обработки, т. е. к выбору более щадящих методов микобактерий туберкулеза. Это связано со значительным изменением свойств микобактерий в результате интенсивной химиотерапии.
Метод Гона. После того как из мокроты обычным способом был приготовлен мазок, мокроту переливают в толстостенную банку с бусами или битым стеклом и гомогенизируют. Гомогенизацию производят энергичным встряхиванием банки в руках или в шютель-аппарате. Гомогенизированную мокроту заливают равным количеством 3—5% серной кислоты и тщательно встряхивают до полного смешивания мокроты с кислотой. Затем, когда мокрота превращается в гомогенную массу, ее переливают в центрифужные пробирки и центрифугируют Обработка мокроты кислотой должна продолжаться 20 минут, из них 10 минут занимает центрифугирование. После окончания центрифугирования надосадочную жидкость сливают в дезинфекционный раствор и осадок засевают на 3—4 пробирки с яичной средой (Гельберга, Петраньяни или Левенштейна — Иенсена). Засев производят петлей (из толстой платиновой проволоки с несколькими оборотами) или пастеровской пипеткой.
Метод Мазура позволяет обходиться без центрифугирования. Гнойные комочки мокроты вносят в широкую пробирку, содержащую 3 мл 2% серной кислоты и энергично встряхивают в течение 3 минут. Туберкулезные микобактерии захватываются образующейся пеной, которую и засевают платиновой петлей. В последние годы для обработки мокроты пользуются комбинацией обоих методов, предложенной Гельбергом. Метод заключается в том, что после посева пены материал центрифугируется и засевается осадок.
Кроме серной кислоты, для освобождения мокроты от вторичной флоры пользуются 2—5% раствором едкого натра с последующей нейтрализацией 4—5% раствором соляной кислоты. Обработка происходит при температуре термостата в течение 30 минут— 1 часа. Для обработки материала с успехом пользуются 10% раствором трехзамещенного фосфорнокислого натрия. Этот раствор хорошо гомогенизирует мокроту и освобождает ее от присутствия вторичной флоры. Хорошо гомогенизированную мокроту заливают двойным количеством этого раствора, хорошо смешивают и оставляют на сутки при температуре термостата. На следующий день весь материал центрифугируют и осадок засевают пипеткой на яичные среды.
ПОСЕВ ЛИКВОРА, МОЧИ, ЭКССУДАТА, ПРОМЫВНЫХ ВОД ЖЕЛУДКА И БРОНХОВ. Всякий жидкий материал, поступающий в лабораторию для посева, сначала необходимо центрифугировать. Если материал не содержит вторичной флоры (ликвор, серозный экссудат), то осадок или нижний слой жидкости в случае отсутствия осадка засевают без обработки на яичные среды. При посеве гнойного экссудата, мочи, промывных вод желудка или бронхов осадок после центрифугирования обрабатывают 3% серной кислотой в течение 20 минут, включая повторное центрифугирование, и после удаления надосадочной жидкости засевают на яичные среды.
Промывные воды желудка необходимо сеять как можно быстрее после их получения, так как жизнеспособность микобактерий в промывных водах под влиянием желудочного сока со временем снижается. Для исследования в лабораторию доставляется все полученное количество промывной жидкости.
ПОСЕВ МАЗКА ИЗ ГОРТАНИ. Микобактерии туберкулеза можно обнаружить в слизи из гортани. Больному предлагают покашлять и под контролем гортанного зеркала ватным тампоном снимают слизь с надгортанника. Тампон, снятый с зонда, помещают в ступку с 3—5% серной кислотой, тщательно отжимают, тампон удаляют, жидкость центрифугируют и осадок засевают на яичные среды. Обработку можно производить и следующим образом тампон осторожно опускают в пробирку с серной кислотой на 20 минут, также осторожно переносят его из пробирки с кислотой в пробирку со стерильным физиологическим раствором на несколько минут, а затем делают посев, втирая тампон в поверхность твердой среды.
Таким же образом делают посев всякого материала, взятого на тампоне; гноя, мазков из ран и т. д.
ПОСЕВ КРОВИ. Кровь берут из вены около 5 мл в пробирку со стерильным раствором лимоннокислого натрия. После центрифугирования осадок гемолизируют стерильной дистиллированной водой, центрифугируют, осадок обрабатывают 3% серной кислотой и после повторного центрифугирования засевают на питательные среды.
УСКОРЕННЫЕ МЕТОДЫ ПОСЕВОВ. Туберкулезные микобактерии на питательных средах растут довольно медленно, значительно медленнее, чем другие патогенные микроорганизмы. Предложены ускоренные методы посевов. Однако надо иметь в виду, что, несмотря на рост в более короткие сроки, эти методы дают все же значительно меньший процент положительных результатов. Поэтому при применении ускоренных методов рекомендуется делать параллельно посев на плотные яичные среды и в случае отсутствия роста при посеве ускоренным методом ждать результатов посева на яичных средах.
Метод Прайса. Из гнойных комочков мокроты делают мазки на стерильных предметных стеклах. Мазки подсушивают, обрабатывают 5% серной кислотой путем погружения мазков в кислоту на 5 минут, затем дважды промывают в стерильной дистиллированной воде и погружают в пробирки с кровяной средой (1 часть крови+3 части воды). Через 7—10 дней стекла извлекают из пробирок, отмывают от крови, сушат, фиксируют и после окраски по Цилю — Нильсену микроскопируют. При микроскопировании в случае роста видны типичные микроколонии палочек в виде «кос» и «жгутов».
Метод Школьниковой — метод глубинного посева на кровяную среду. Материал обрабатывают как обычно. Перед посевом осадок дважды отмывают при центрифугировании стерильной дистиллированной водой. Через 10—20—30 дней делают мазки из отцентрифугированного и отмытого осадка. Этот метод более чувствителен и дает больше положительных результатов, чем метод Прайса. Количество положительных результатов повышается при высевах с кровяной среды на яичную.
Туберкулезные микобактерии растут медленно, поэтому пробирки нужно выдерживать в термостате (при температуре 37—38°) в течение 2—3 месяцев, если рост не появляется раньше, и только после этого срока может быть дан отрицательный ответ. При появлении роста делают мазки из выросшей культуры, окрашивают по Цилю — Нильсену и микроскопируют. Если культура вырастает в обычные сроки, имеет типичные культуральные и морфологические признаки, то дается положительный ответ. При появлении роста в более ранние сроки в случае обнаружения каких-либо особенностей в культуральных и морфологических свойствах (пигментированная культура, нетипичный рост) культура подлежит дальнейшему изучению.
БИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА.
При отрицательных результатах бактериоскопии и посева материала, исследуемого на микобактерии туберкулеза, если все же подозревается туберкулез, прибегают к опытам на животных (биологическая проба) как наиболее чувствительному методу выявления возбудителя туберкулеза. Диагностическим лабораторным животным является морская свинка. Этот метод дает возможность определить в патологическом материале жизнеспособных и вирулентных микобактерий. Надо учесть, однако, что микобактерии туберкулеза, устойчивые к препаратам гидразидов изоникотиновой кислоты (фтивазид и др.), вследствие снижения или потери вирулентности могут не вызвать туберкулеза у свинки.
Патологический материал для заражения животных собирают и обрабатывают так же, как и для посева, но здесь, кроме того, требуется тщательное отмывание осадка от следов серной кислоты (дважды физиологическим раствором с последующим центрифугированием), чтобы нейтрализовать вредное действие кислоты на животное. После нового добавления к осадку физиологического раствора полученную эмульсию вводят в количестве 0,5—2 мл морской свинке подкожно в правую паховую область. Зараженных животных помещают в отдельные клетки (при заражении одним и тем же материалом двух и больше животных их можно поместить в общую клетку, если позволяют размеры последней) и подвергают их систематическому наблюдению, обращая внимание на вес, изменения на месте введения материала и регионарных лимфатических узлов, а также общее состояние животного. Если животное не погибает от патологического процесса, то его забивают через 3—5 месяцев. Секционный материал от животного подвергают тщательному патологоанатомическому исследованию на туберкулез, если нужно, гистологическому и бактериологическому. Для ускорения диагностики туберкулеза у подкожно зараженной морской свинки можно, не ожидая гибели или забоя животного, произвести бактериоскопию на микобактерии туберкулеза содержимого регионарных к месту заражения лимфатических узлов или инфильтратов на месте инъекции.
Автор: Сейтимова Молдир
Областной противотуберкулезный диспансер
Источник
Лабораторные методы исследования при туберкулезе
Исследование мокроты . Выявление МБТ в мокроте имеет важное эпидемиологическое и клиническое значение.
Мокроту лучше собирать утром. Предварительно больной должен прополоскать рот, чтобы в мокроте было меньше слюны. При малом количестве мокроты ее собирают в течение суток.
При отсутствии мокроты следует вызвать ее появление раздражающими ингаляциями аэрозоля гипертонического раствора поваренной соли с содой.
Исследуют также промывные воды бронхов, получаемые после введения через трахею 10—12 мл теплого изотонического раствора хлорида натрия.
Исследование мокроты начинают с ее осмотра. У больных туберкулезом легких в мокроте могут быть прожилки или сгустки крови, кусочки обызвествленных камней бронхов — бронхолитов.
При микроскопическом исследовании окрашенных мазков мокроты у больных с деструкцией легочной ткани выявляются эластические волокна. Иногда встречаются так называемые коралловые волокна, которые образуются в результате отложения на эластических волокнах жирных кислот, а также покрытые известью эластические волокна и аморфные известковые частицы.
Для выявления в мокроте МБТ ее исследуют неоднократно, направляя в лабораторию утреннюю порцию не менее 3 дней подряд. В ряде случаев МБТ могут быть обнаружены в мокроте и при отсутствии рентгенологических изменений в легких (в этом случае нельзя исключить и язвенный туберкулез бронха). Проводить исследование мокроты необходимо до начала противотуберкулезной химиотерапии.
Выявление МБТ в патологическом материале осуществляется бактериоскопическим, бактериологическим (культуральным) и биологическим методами.
Кроме мокроты, объектами исследования для обнаружения МБТ могут быть также моча, кал, спинномозговая жидкость, экссудат из полостей, биоптаты различных тканей.
Основным методом выявления МБТ является бактериоскопический. Во многих развивающихся странах он широко применяется не только для диагностики, но и для выявления больных туберкулезом при массовых обследованиях населения.
При прямой бактериоскопии препарат окрашивают по методу Циля — Нильсена: вначале карболовым раствором фуксина, а затем после обесцвечивания 5 % раствором серной кислоты или 3 % раствором солянокислого спирта, докрашивают 0,25 % раствором метиленового синего. Окрашенные препараты микроскопируют в иммерсионной системе. МБТ окрашиваются в красный, а окружающий фон и некислотоустойчивые микроорганизмы — в синий цвет.
Информативность бактериоскопического метода выявления МБТ увеличивается на 14—30 % при применении люминесцентной микроскопии. Для окраски препарата используют флюорохромы — органические красители, флюоресцирующие при освещении ультрафиолетовыми, фиолетовыми или синими лучами. Такими красителями являются аурамин, родамин С. Препарат исследуют с помощью люминесцентного микроскопа. МБТ светятся золотисто-желтым цветом на темном фоне.
Для обнаружения бактериоскопическим методом МБТ в препарате необходимо, чтобы в 1 мл мокроты содержалось не менее 100 000 микробных тел. При меньшем числе микобактерий исследование может дать ложноотрицательный результат.
Для увеличения количества МБТ в единице исследуемого объема мокроты используют методы флотации и седиментации, особенно при отрицательных результатах прямой бактериоскопии.
Наибольшее распространение получил метод флотации, основанный на том, что после встряхивания водной суспензии с углеводородом МБТ всплывают вместе с образующейся пеной на поверхность. В качестве углеводорода используют бензин, бензол, ксилол. Образующееся на поверхности сливкообразное (флотационное) кольцо из частиц углеводорода с микобактериями служит материалом для приготовления препаратов. При использовании метода флотации число положительных результатов бактериоскопии увеличивается на 10 %.
Бактериологический (культуральный) метод выявления МБТ заключается в посеве мокроты на питательные среды. Перед посевом мокроту обрабатывают с целью подавления роста неспецифической микрофлоры. Стандартной питательной средой для выращивания МБТ служит твердая яичная среда Левенштейна — Йенсена. Существуют также полужидкие и жидкие питательные среды. Рост культуры МБТ происходит за 14—90 дней.
Для выделения культуры МБТ достаточно 20—100 микробных клеток в 1 мл мокроты. Получение чистой культуры микобактерий позволяет определить их жизнеспособность, вирулентность, а также чувствительность к лекарственным препаратам.
Нередко определяемые при бактериоскопии микобактерии не растут на питательных средах вследствие утраты способности к размножению под влиянием химиопрепаратов. По данным бактериологического исследования проводится количественная оценка бактериовыделения: скудное — до 50 колоний на среде и обильное — более 50 колоний.
Биологический метод заключается в заражении инфицированной мокротой животных (морских свинок), обладающих высокой чувствительностью к МБТ.
Перед заражением животных мокроту обрабатывают серной кислотой с целью уничтожения неспецифической микрофлоры и центрифугируют. Осадок (в изотоническом растворе хлорида натрия) вводят свинке подкожно в паховую область, внутрибрюшинно или в яичко. С целью снижения резистентности морской свинки к МБТ ей ежедневно вводят большие дозы кортизона. Примерно через месяц после заражения у свинки увеличиваются лимфатические узлы и развивается генерализованный туберкулез.
Среди методов выявления МБТ и диагностики туберкулеза биологический метод до последнего времени считался наиболее чувствительным, так как туберкулез у морских свинок может быть вызван при введении мокроты, содержащей менее 5 микробных тел в 1 мл.
В настоящее время доказана возможность потери вирулентности микобактериями туберкулеза. Такие микобактерии жизнеспособны, могут расти на питательных средах, но не вызывают заболевания экспериментальных животных. Поэтому для выявления в патологическом материале МБТ необходимо применять различные методы микробиологического исследования.
Исследование крови . В крови больных туберкулезом обычно отмечаются небольшие изменения. Гипохромная анемия определяется лишь у больных с распространенным процессом и выраженной интоксикацией или при повторяющихся легочных кровотечениях. СОЭ увеличивается в периоды обострения туберкулезного процесса.
Изменение числа лейкоцитов и лейкоцитарной формулы крови происходит главным образом при острых процессах и распаде легочной ткани. Могут наблюдаться лейкоцитоз, увеличение числа палочкоядерных нейтрофилов, лимфопения, моноцитоз, эозинопения.
Для оценки состояния больного, его неспецифической и специфической реактивности, а также для определения активности туберкулезного процесса и выбора оптимальной лечебной тактики существенное значение имеет определение некоторых биохимических и иммунологических показателей.
У больных туберкулезом, выделяющих большое количество мокроты, с обильным гнойным плевральным экссудатом, амилоидозом почек может иметь место гипопротеинемия в отличие от больных с другими формами туберкулеза.
При остром туберкулезном воспалении уменьшается альбумин-глобулиновый коэффициент, увеличивается содержание в плазме фибриногена и сиаловых кислот, появляется С-реактивный белок.
Для контроля функционального состояния печени и почек в крови определяют содержание аланиновой и аспарагиновой аминотрансфераз, щелочной фосфатазы, билирубина, уровень остаточного азота, мочевины, креатинина, с сывороткой крови ставят коагуляционные пробы — тимоловую, сулемовую. С целью исключения часто сочетающегося с туберкулезом сахарного диабета в крови определяют содержание глюкозы.
Для подтверждения туберкулезной этиологии заболевания используют иммуноферментный метод, основанный на реакции антиген — антитело. При подозрении на иммунодефицит в сыворотке крови определяют содержание иммуноглобулинов. Для диагностики иммунодефицита и контроля за его течением определяют количество В- и Т-лимфоцитов.
При активном туберкулезе все иммунологические реакции положительны, причем их выраженность зависит от фазы туберкулезного процесса. У больных с благоприятным течением туберкулеза наиболее выражена реакция бласттрансформации лимфоцитов, а с прогрессирующим — реакция торможения миграции лейкоцитов в присутствии туберкулина ППД.
При вспышке процесса снижается число Т-розеткообразующих лимфоцитов и повышается число В-розеткообразующих лимфоцитов, одновременно уменьшается содержание G- и А-иммуноглобулинов.
Иммунологические тесты используются для дифференциальной диагностики туберкулеза. Например, при раке и саркоидозе в отличие от туберкулеза отмечается подавление активности Т-лимфоцитов в реакции бласттрансформации с фитогемагглютинином (ФГА), у большинства больных отмечаются отрицательные реакции бласттрансформации лимфоцитов и миграции лейкоцитов с ППД.
Исследование мочи . У больных туберкулезом легких анализ мочи обычно
не дает существенной диагностической информации, но иногда выявляются серьезные осложнения основного заболевания. При туберкулезе почек в моче обнаруживают белок, лейкоциты, нередко эритроциты, а также МБТ. При осложнении легочного туберкулеза амилоидозом наблюдаются стойкая протеинурия, микрогематурия.
По выделению с суточной мочой 17-кетостероидов и 17-оксикортикостероидов судят о функциональном состоянии коры надпочечников.
Подготовила: Кулмаганбетова Ж.Ш — врач бактериолог ГККП Кызылординский Областной противотуберкулезный диспансер
Источник
