Метод бродильной пробы вода

Санитарный контроль

в пищевой промышленности

Исследование воды (часть 4)

Оксидазный тест предназначен для дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae от грамотрицательных бактерий семейства Pseudomonadaceae и других водных сапрофитных бактерий, которые обладают активной оксидазой и окисляют фенилендиаминовые соединения до индофенола, окрашивающего колонии в ярко-синий цвет.

Для определения оксидазной активности бактерий готовят специальный реактив: 30—40 мг α-нафтола растворяют в 2,5 мл ректификованного этилового спирта, добавляют 7,5 мл дистиллированной воды и 40—60 мг диметил-n-фенилендиамина. Реактив готовят непосредственно перед определением.

Мембранный фильтр с выросшими на нем колониями бактерий переносят пинцетом, не переворачивая, на кружок фильтровальной бумаги, обильно смоченный реактивом. Через 2—4 мин оценивают результат.

Колонии посиневшие или с синим ободком относят к семейству Pseudomonadaceae и при анализе не учитывают.

Колонии, не изменившие своего первоначального цвета, — оксида-зоотрицательные, относят к семейству Enterobacteriaceae. Отсутствие оксидазы у темно-красных с металлическим блеском и без него колоний грамотрицательных палочек позволяет дать положительный ответ о наличии бактерий группы кишечных палочек и закончить исследование воды подсчетом оксидазоотрицательных колоний и вычислением коли-индекса.

При обнаружении на фильтрах розовых и бесцветных колоний грамотрицательных палочек с отрицательной оксидазной активностью их подсчитывают и 2—3 изолированных колонии каждого типа высевают в полужидкую среду с глюкозой. Культивируют при 37°С и проводят учет через 4—5 ч. Наличие кислоты и газа в полужидкой среде с глюкозой подтверждает принадлежность этих бактерий к группе кишечных палочек.

Коли-индекс вычисляют следующим образом. Количество бактерий группы кишечных палочек, выросших при посеве исследуемого объема воды, умножают на 1000 мл и делят на весь объем исследуемой воды.

Если на одном из фильтров наблюдается сплошной рост бактерий и подсчет их невозможен, то коли-индекс вычисляют по тому объему, в котором на фильтре выросли изолированные колонии. Например, в 100 мл посеянного объема из фильтре сплошной рост бактерий, в объеме 10 мл на фильтре выросло 12 колоний бактерий кишечной палочки, следовательно, коли-индекс равен (12·1000) : 10= 1200.

Метод бродильных проб. Сущность метода заключается в следующем. Производят посев определенных объемов исследуемой воды в глюкозо- или лактозопептонные среды и культивируют при 37°С в течение 24 ч. Затем высевают на среду Эндо, изучают выросшие колонии и по табл. 16, 17, 18 определяют наиболее вероятное число бактерий группы кишечных палочек в 1 л воды.

Воду методом бродильных проб исследуют в три этапа. На первом этапе определенные объемы исследуемой воды высевают во флаконы и пробирки с глюкозопептонной средой и индикатором. Флаконы (пробирки) снабжены поплавками для учета газообоазования. Посев 100 и 10 мл воды производят во флаконы и пробирки с 10 и 1 мл концентрированной среды; посев 1 и 0,1 мл воды — в пробирки с 10 мл среды нормальной концентрации. Посевы культивируют при 37°С в течение 24 ч.

На втором этапе исследования из флаконов и пробирок, где отмечено помутнение, образование кислоты и газа, производят высев бактериологической петлей штрихами на поверхность среды Эндо (предварительно чашку со средой Эндо со стороны дна делят на секторы). Посевы культивируют при 37°С 18—24 ч.

Источник

Бродильный метод

Засевают 3 объёма воды по 100 мл (для качественного анализа) или при исследовании воды с целью количественного определения общих колиформных бактерий делают посев 3 объёмов по 100 мл, 3 – по 10 мл и 3 – по 1 мл.

Посев 100 мл и 10 мл воды производят в 10 и 1 мл концентрированной лактозо-пептонной среды, посев 1 мл воды – в 10 мл среды обычной концентрации.

Посевы инкубируют при 37 0 C в течение 24-48 часов. Через 24 часа из питательной среды, где отмечено наличие роста и образование газа, делают высев по секторам на среду Эндо, приготовленную с добавлением фуксина.

Положительный результат на присутствие общих колиформных бактерий в данном объёме воды дают по помутнению и образованию газа на среде накопления (глюкозо-пептонная среда или лактозо-пептонная среда) и наличию красных колоний на среде Эндо. В сомнительных случаях выполняют оксидазный тест и подтверждают способность к газообразованию на среде с лактозой или маннитом (глюкозой).

Результат отрицательный, если

– в среде накопления нет признаков роста,

– на секторах среды Эндо нет роста лактозоположительных колоний,

– на секторах среды Эндо выросли нехарактерные для колиформных бактерий колонии,

– все колонии оказались оксидазоположительными,

– если в подтверждающем тесте на среде с лактозой или маннитом (глюкозой) не отмечено газообразования.

Наиболее вероятное число (НВЧ) бактерий (общих и термотолерантных колиформных бактерий) – вычисляют по специальным таблицам.

Санитарно-микробиологическое состояние воздухазакрытых помещений оценивают по общему микробному числу (ОМЧ) – количеству особей, обнаруживаемых в 1 м 3 воздуха, наличию санитарно-показательных бактерий: гемолитических стрептококков, золотистых стафилококков, а также дрожжевых и плесневых грибов.

Согласно СанПиН 2.1.3.1375-03, воздушная среда помещений лечебных учреждений и аптек по уровню бактериальной обсемененности разделена на 4 класса.

Микробиологические показатели для оценки воздушной среды аптечных учреждений можно определить путем посева воздуха седиментационным (по Коху) или аспирационным методом (в аппарате Кротова).

Допустимые уровни бактериальной обсеменённости воздушной среды помещений лечебных учреждений в зависимости от их
функционального назначения и класса чистоты

Класс чистоты	Название помещений	Санитарно-микробиологические показатели
общее количество микроорганизмов в 1 м 3 воздуха (КОЕ/м 3 )	количество колоний S.aureus в 1 м 3 воздуха (КОЕ/м 3 )	количество плесневых и дрожжевых грибов в 1 дм 3 воздуха
До начала	Во время работы	До начала	Во время работы	До начала	Во время работы
Особо чистые (А)	Операционные, родильный зал, асептические боксы для гематологических, ожоговых больных, палата для недоношенных, асептический блок аптек, стерилизационные (чистая половина) боксы бактериологических лабораторий	не более 200	не более 500	не должно быть	не должно быть	не должно быть	не должно быть
Чистые (Б)	Процедурные, перевязочные, предоперационные, палаты реанимации, залы реанимации, детские палаты, комнаты сбора и пастеризации грудного молока, ассистентские и фасовочные аптек, дистилляторная, помещения бактериологических и клинических лабораторий, предназначенные для исследований	не более 500	не более 750	не должно быть	не должно быть	не должно быть	не должно быть
Условно чистые (В)	Палаты хирургических отделений; коридоры, примыкающие к операционным и родильным залам; смотровые, боксы и палаты инфекционных отделений, ординаторские, материальные, кладовые чистого белья	не более 750	не более 1000	не должно быть	не более 2	не должно быть	не должно быть
Грязные (Г)	Коридоры и помещения административных зданий, лестницы, лечебно-диагностические, санитарные комнаты, туалеты, комнаты грязного белья	Не нормируются

Седиментационный метод (по Коху) – оседание микробов под действием силы тяжести — является простым способом изучения микрофлоры воздуха. Он заключается в том, что чашки Петри со средой оставляют открытыми на определённое время (5-10 минут на общую обсеменённость и не менее 40 минут на кокковую микрофлору), затем их закрывают, маркируют и выдерживают 24 часа в термостате и 24 часа при комнатной температуре. Количество выросших колоний соответствует степени загрязнённости воздуха: по приблизительному подсчёту на площадь 100 см 2 в течение 5 минут оседает столько микробов, сколько их содержится в 10 л воздуха.

Аспирационный метод – более точный количественный метод определения микробного числа воздуха. Посев воздуха осуществляется с помощью приборов. Аппарат Кротова устроен таким образом, что воздух с заданной скоростью просасывается через узкую щель плексигласовой пластины, закрывающей чашку Петри с питательным агаром. При этом частицы аэрозоля с содержащимися на них микроорганизмами равномерно фиксируются на всей поверхности среды благодаря постоянному вращению чашки под входной щелью.

После инкубации посева в термостате проводят расчет микробного числа по формуле:

ОМЧ	=	N ∙ 1000
V

где N – количество выросших на чашке колоний;

V – объём пропущенного через прибор воздуха, дм 3 ;

1000 — искомый объём воздуха, дм 3 .

Наличие санитарно-показательных для воздуха микроорганизмов – золотистого стафилококка, гемолитического стрептококка, плесневых грибов, кандид – определяют по характеру выросших колоний на специальных средах (желточно-солевом агаре, кровяном агаре, среде Сабуро) и при микроскопическом изучении бактерий из этих колоний.

Контрольные вопросы

Каковы особенности ферментных систем бактерий? Как регулируется продукция ферментов у бактерий? Какие группы ферментов различают в зависимости от механизма, которым регулируется продукция фермента? Какое практическое значение имеет изучение ферментативной активности бактерий? Методы изучения сахаролитической и протеолитической активности бактерий. Дифференциально-диагностические среды: перечислите, назовите основные составные части и применение. На какое изменение среды реагирует индикатор в этих средах? По какому признаку дифференцируются бактерии на средах Эндо, Левина, Плоскирева? Каким свойством должны обладать бактерии, чтобы образовать на этих средах окрашенные колонии? Если бактерии образуют бесцветные колонии, что это означает? Среды Гисса их состав и применение. Что такое «пёстрый» или «цветной» ряд? Среда Олькеницкого, её состав; как производится посев и как отмечают на этой среде ферментацию разных углеводов, образование сероводорода? Что представляют собой микротест-системы для определения ферментативной активности микробов; как производят посев и как учитывают результаты? Что такое СИБ; как используется эта система, как производится посев и учёт результатов? Укажите основные объекты внешней среды, которые подвергаются санитарно-бактериологическому исследованию. Микробиоценоз, определение понятия. Перечислите и дайте характеристику межвидовых взаимоотношений в микробиоценозах. Какие показатели определяются при бактериологической оценке объектов внешней среды? Санитарно-показательные микроорганизмы: определение понятия. Какими свойствами должны обладать санитарно-показательные микроорганизмы? Перечислите санитарно-показательные микроорганизмы для воздуха, воды, почвы. Микрофлора воды: постоянная микрофлора, источники загрязнения. Показатели для санитарно-бактериологической оценки воды. Методика определения общего микробного числа воды. Показатели фекального загрязнения воды, методы их определения. Укажите предельно допустимые показатели для питьевой воды. Микрофлора воздуха: постоянная микрофлора, источники загрязнения. Показатели для санитарно-бактериологической оценки воздуха, методы их определения. Микрофлора почвы: постоянная микрофлора, её значение для круговорота веществ в природе. Источники загрязнения почвы патогенными микроорганизмами. Показатели для санитарно-бактериологической оценки. Для каких заболеваний факторами передачи могут быть вода, воздух, почва? Некультивируемые формы бактерий: определение понятия, практическое значение.

Дата добавления: 2015-08-04 ; просмотров: 2266 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ

Источник

18.3. Методы определения общих и термотолерантных колиформных бактерий в воде

Общие колиформные бактерии (ОКБ) – это грамотрицательные, оксидазоотрицательные палочки, не образующие спор, растущие на дифференциальных лактозных средах, фер­ментирующие лактозу до кислоты, альдегида и газа при тем­пературе 37±1 °С в течение 24–48 ч. Термотолерантные коли­формные бактерии (ТКБ) входят в число ОКБ, обладают всеми их признаками и, кроме того, способны ферментировать лак­тозу до кислоты, альдегида и газа при температуре 44±0,5 °С в течение 24 ч.

ОКБ и ТКБ в воде, согласно действующим МУ 2.1.4.1018–01, определяют мембранным и титрационным (бродильным) мето­дами. Титрационный метод используют только при отсутствии материалов и оборудования, необходимых для выполнения анализа методом мембранной фильтрации, наличии в воде большого количества взвешенных веществ и в случае преобла­дания посторонней микрофлоры, препятствующей получению на фильтрах изолированных колоний.

18.3.1. Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий методом мембранной фильтрации

Сущность метода заключается в концентрировании бакте­рий из определенного объема воды на мембранных фильтрах с подращиванием их на среде Эндо при 37±1,0 °С, дифферен­цировании по культуральным и биохимическим тестам и под­счете выросших колоний.

Первый день. 1. Подготовка мембранных фильтров. Мембранные фильтры с диаметром пор не более 0,45 мкм и разме­ром диска 35 или 47 мм (ацетатцеллюлозные, нитратцеллюлозные, ядерные и др.), имеющие сертификат качества, выпуска­ются стерильными, в противном случае их стерилизуют методом кипячения по инструкции, предложенной изготовителем.

1. Подготовка фильтровального аппарата. Фильтровальный аппарат, воронку и столик фильтровального аппарата обтирают и фламбируют марлевым (ватным) тампоном, смоченным спиртом. После охлаждения на столик фильтровального аппа­рата кладут фламбированным пинцетом стерильный мембран­ный фильтр, прижимают его воронкой. Если вода содержит большое количество взвешенных веществ или клеток, ее сна­чала фильтруют через фильтр с большим диаметром пор, по­мещая его поверх основного фильтра с диаметром пор 0,45 мкм.
2. Фильтрование воды. В воронку прибора для фильтрования наливают отмеренный объем воды, затем создают вакуум. При посеве нескольких объемов одной пробы следует фильтровать через один фильтровальный аппарат без обеззараживания сна­чала меньшие, а затем большие объемы воды, меняя каждый раз фильтры. Перед фильтрованием каждой новой пробы при­бор обеззараживают. Вначале фильтруют пробы обеззаражен­ной воды или предположительно незагрязненные, а затем фильтруют загрязненные пробы. При фильтровании 1 мл ис­следуемой воды в воронку наливают предварительно не менее 10 мл стерильной воды, а затем вносят анализируемую воду.

После окончания фильтрования и осушения фильтра от­ключают вакуум, воронку снимают, фильтр осторожно подни­мают за край фламбированным пинцетом и переносят его, не переворачивая, на питательную среду Эндо (рецепты 96, 97), разлитую в чашки Петри, избегая пузырьков воздуха между средой и фильтром. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх.

Под каждым фильтром на дне чашки делают надпись с указанием объема профильтрованной воды, номера пробы и даты посева. На одну чашку помещают 3–4 фильтра с усло­вием, чтобы фильтры не соприкасались. Чашки с фильтрами ставят в термостат дном вверх и инкубируют посевы при тем­пературе 37±1 °С в течение 24±2 ч.

При исследовании питьевой воды анализируют 3 объема по 100 мл. При получении стабильных отрицательных результатов допустима фильтрация 300 мл воды через один фильтр.

Объем воды водоемов для посева выбирают в зависимости от степени ее предполагаемого загрязнения. Рассчитывают, чтобы не менее чем на двух фильтрах выросли изолированные колонии. Из них не более 30 колоний на фильтрах диаметром 35 мм или не более 50 колоний на фильтрах диаметром 47 мм должны быть образованы колиформными бактериями. При этом можно ориентироваться на результаты предыдущих ис­следований.

При исследовании воды неизвестной степени бактериаль­ного загрязнения следует засевать не менее четырех-десяти-кратных ее объемов.

Так, например, для воды водоемов, загрязняемых сточными водами, рекомендуется брать объемы 10; 1; 0,1; 0,01 мл. При анализе воды водоемов в зоне влияния выпуска сточных вод – 0,1; 0,01; 0,001; 0,0001 мл; для чистых водоемов – 100; 50; 10; 1 мл. При анализе воды незагрязненных шахтных колодцев фильтруют 100; 10; 1 и 0,1 мл.

Второй день. По окончании инкубации производят про­смотр посевов:

• • отсутствие микробного роста или обнаружение колоний, не характерных для ОКБ (пленчатые, губчатые, плесневые, прозрачные, расплывчатые), позволяет на этом этапе ана­лиза закончить исследования с выдачей отрицательного ре­зультата (отсутствие ОКБ и ТКБ в исследуемом объеме воды). Анализ заканчивают через 24 ч;
• • при обнаружении на фильтрах типичных лактозоположительных колоний (темно-красных, красных с металличес­ким блеском или без него либо других подобного типа колоний с отпечатком на обратной стороне фильтра) иссле­дования продолжают. Подсчитывают число колоний каждо­го типа отдельно и приступают к подтверждению их при­надлежности к ОКБ и ТКБ.

Каждую выбранную изолированную колонию исследуют на наличие оксидазной активности (см. гл. 9, рецепт 75). Оксидазный тест предложен для дифференциации бактерий семей­ства Enterobacteriaceae от грамотрицательных бактерий семей­ства Pseudomonadaceae и других водных сапрофитов, которые в отличие от кишечных бактерий вырабатывают фермент оксидазу.

Готовят мазки, окрашивают их по Граму, микроскопируют или определяют принадлежность к грамотрицательным бакте­риям постановкой теста Грегерсена, не требующего использования оптики (см. гл. 6). Подтверждают ферментацию лактозы до кислоты и газа.

Оставшуюся часть оксидазоотрицательной грамотрицательной изолированной колонии засевают параллельно в две про­бирки с лактозной средой (рецепт 99).

• — для подтверждения наличия ОКБ посев инкубируют при температуре 37±1 °С в течение 48 ч;
• — для подтверждения наличия ТКБ посев осуществляют в среду, предварительно прогретую до температуры 43–44 °С, и инкубируют при температуре 44±0,5 °С в течение 24 ч.

Первичный учет образования кислоты и газа на подтверж­дающих полужидких средах и СИБ-лактозы (коммерческие полоски) возможен через 4–6 ч. При обнаружении кислоты и газа в среде с лактозой дают положительный ответ. При отсут­ствии кислоты и газа или при наличии только кислоты про­бирки с посевами для окончательного учета ТКБ оставляют до 24 ч. Пробирки с посевами для подтверждения наличия ОКБ после просмотра через 24 ч и получения отрицательного ре­зультата оставляют для окончательного учета до 48 ч.

При лабораторно-производственном контроле качества воды поверхностных водоемов анализ может быть завершен подсчетом колоний, которые отнесены к ОКБ по двум призна­кам: отрицательному оксидазному тесту и ферментации лакто­зы на среде Эндо до кислоты и альдегида. Дальнейшее под­тверждение ОКБ по способности образовывать газ на лактозных средах проводят только при отсутствии достаточно четкой дифференциации лактозоположительных колоний, при росте мелкоточечных или мелких плоских колоний, не характерных для колиформных бактерий, при небольшом опыте работы выполняющего анализ.

Учет результатов. Грамотрицательные колонии учитывают­ся как ОКБ при отрицательном оксидазном тесте и фермента­ции лактозы при температуре 37 °С с образованием кислоты и газа.

Грамотрицательные колонии учитываются как ТКБ при от­рицательном оксидазном тесте и ферментации лактозы при температуре 44 °С с образованием кислоты и газа.

При анализе питьевой воды, воды водоемов число колониеобразующих единиц ОКБ и ТКБ подсчитывают на всех фильт­рах и выражают результат анализа в КОЕ на 100 мл воды.

Вычисление проводят по формуле:

где X – число колоний в 100 мл; V – профильтрованный через фильтры объем воды; а – число подсчитанных на этих фильт­рах колоний в сумме.

1. При посеве по 100 мл воды на 3 фильтрах выросло две колонии на одном фильтре, на остальных двух фильтрах нет роста. Число общих или термотолерантных колиформных бак­терий будет:

1. При посеве 10, 40, 100 и 150 мл воды на фильтрах с профильтрованным объемом 40 мл выросло 4 изолированные колонии, с профильтрованным объемом 100 мл – 3 ОКБ. Фильтры с объемами 10 и 150 мл заросли и учету не подлежат. Суммируют общее число колоний ОКБ (ТКБ) на тех фильтрах, где получены изолированные колонии, пересчитывают это чис­ло на объем 100 мл.

Питьевая вода, вода водоемов удовлетворяют требованиям в том случае, когда ОКБ и ТКБ не обнаруживают в 100 мл воды. При установлении бактериальной загрязненности воды свыше допустимых норм прибегают к повторному исследова­нию воды.

18.3.2. Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий титрационным методом

Первый день: а) при исследовании питьевой воды засевают 3 объема по 100 мл (качественный метод). При исследованиях воды с целью количественного определения ОКБ и ТКБ при повторном анализе производят посев: трех объемов по 100 мл, трех объемов по 10 мл, трех объемов по 1 мл;

б) посев воды водоемов производят в двух или трех повторностях. Воду водоемов, не загрязняемых сточными водами, засевают в объемах по 10; 1; 0,1; 0,01 мл; воду водоемов, загрязняемых сточными водами, – по 1; 0,1; 0,01; 0,001 мл; воду водоемов в зоне влияния выпусков сточных вод – в объе­ме по 0,1; 0,01; 0,001; 0,0001 мл.

Каждый объем исследуемой воды засевают в лактозопептонную среду (рецепт 95). Посев 100 и 10 мл воды производят в 10 и 1 мл концентрированной лактозопептонной среды, посев 1 мл пробы проводят в 10 мл среды обычной концентрации.

Второй день. Посевы инкубируют при 37±1 °С. Не ранее 24 ч инкубации проводят предварительную оценку посевов. Из ем­костей, где отмечено наличие роста (помутнение) и образова­ние газа, производят высев бактериологической петлей на сек­тора среды Эндо (рецепты 96, 97) для получения изолирован­ных колоний.

Емкости без наличия роста и образования газа оставляют в термостате и окончательно просматривают через 48 ч. Посевы без признаков роста считают отрицательными, и дальнейшему исследованию они не подлежат. Из емкостей, где отмечено помутнение и образование газа или только помутнение, делают высев на сектора среды Эндо.

Посевы на среде Эндо инкубируют при температуре 37±1 °С в течение 18–20 ч.

При образовании помутнения и газа в среде накопления и росте на среде Эндо колоний, типичных для лактозоположительных бактерий (темно-красных или красных, с металличес­ким блеском или без него, выпуклых с красным центром и отпечатком на питательной среде), дают положительный ответ на присутствие ОКБ в данном объеме пробы.

Отрицательный ответ выдается, если в среде накопления и на секторах среды Эндо не отмечено роста; на секторах среды Эндо выросли не характерные для колиформных бактерий колонии; все колонии оказались оксидазоположительными; все бактерии оказались грамположительными; не отмечено га­зообразования в подтверждающем тесте на среде с углеводом.

Для определения секторов среды Эндо, где выросли типич­ные лактозоположительные колонии, делают посев 2–3 изо­лированных колоний каждого типа с каждого сектора в про­бирки с любой из лактозных сред (рецепты 99, 100).

Среду перед посевом нагревают на водяной бане или в термостате до 44 °С. Немедленно после посева пробирки по­мещают в термостат и инкубируют при температуре 44±0,5 °С в течение 24 ч. Допускается просмотр посевов через 4–6 ч.

При образовании газа в среде накопления, росте на среде Эндо лактозоположительных бактерий и выявлении способ­ности этих бактерий ферментировать лактозу до кислоты и газа в течение 24 ч при температуре 44 °С дают положительный ответ на наличие в этом объеме пробы воды ТКБ. Во всех остальных случаях выдают отрицательный ответ.

Для ускорения выдачи ответа на присутствие ТКБ произво­дят высев 1 мл из объемов среды накопления, где отмечено помутнение и газообразование в пробирке с лактозо-пептонной средой с поплавком и прогретой предварительно до тем­пературы 44 °С. Посевы выдерживают в термостате при темпе­ратуре 44±0,5 °С в течение 24 ч. При обнаружении кислоты и газа дают положительный ответ.

Учет результатов. При обнаружении ОКБ и ТКБ хотя бы в одном из трех объемов питьевой воды выдается ответ об обнаружении ОКБ и ТКБ в 100 мл.

При исследовании количественным методом определяют наиболее вероятное число (НВЧ) ОКБ и ТКБ питьевой воды (табл. 18.1), воды водоемов (табл. 18.2).

Источник